PCR實驗出現(xiàn)凝膠涂布貨片狀條帶彌散的原因

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）,一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的大特點，是能將微量的DNA大幅增加。PCR的原理：PCR的基本過程類似于DNA的天然復(fù)制，特異性依賴于與靶序列兩端互補的Oligo引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

PCR實驗中擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散的原因如下：

（1）酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。

（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

（3）MgCl2濃度過高。可適當(dāng)降低其用量。

（4）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。

（6）循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。

（7）退火溫度過低。

（8）電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒有凝固好；

③瓊脂糖質(zhì)量差。

（9）若為PCR試劑盒則可能：

①由于運輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效；

②試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。

（10）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。